Generación de mutantes mediante tecnología CRISPR/Cas en Arabidopsis

Descripción de la prestación

En proyectos de edición génica mediante CRISPR-Cas9 se incluirían las siguientes etapas: ETAPA 1. Análisis bioinformático del gen o genes diana. Elección de las zonas de la secuencia adyacentes a los PAM sites, con mejor estadística y que no generen mutaciones ¿run-off¿ en otros genes del mismo organismo. Búsqueda de dianas de restricción que ayuden al genotipado. Utilización de las plataformas CRISPR-Plant y otras para diseño de los RNA de guiado. Elección del tipo de vector (línea germinal, U6) en función del objetivo del proyecto. ETAPA 2. Clonaje de las secuencias diana en el vector de destino mediante la técnica de Golden Cloning. Transformación en Agrobacterium tumefaciens. ETAPA 3. Transformación estable. ETAPA 4. Selección de líneas transformadas y positivas para Cas9. Genotipado mediante enzimas de restricción y secuenciación de las secuencias diana. ETAPA 5. Segregación de las diferentes líneas transgénicas (T1 a T3). Genotipado mediante PCR y secuenciación.