Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

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RETROTRANSCRIPCIÓN DE RNA La transcripción reversa (RTPCR) es una técnica que permite sintetizar DNA complementario (cDNA) a moléculas de RNA usando para ello la enzima transcriptasa reversa. El cDNA obtenido es la cadena complementaria de la cadena molde de RNA. El kit High Capacity cDNA Reverse Transcription de la casa comercial Applied Biosystems utiliza una mezcla de cebadores de ocho nucleótidos con secuencias generadas al azar (random primers) para iniciar la síntesis de la hebra de DNA complementario.El Kit permite retrotranscribir entre 0.02 y 2 ug de RNA total en un volumen final de 20ul utilizando la enzima Multiscribe. Los random primers aseguran que la primera hebra de síntesis se produzca eficientemente a partir de todas las moléculas de RNA presentes, tanto RNAm (mensajero) como RNAr (ribosómico). COMO TRAER LAS MUESTRAS AL SERVICIO Los usuarios prepararán cada muestra en un tubo eppendorf de 0.2 ml y en un volumen final de 10ul. Las muestras de RNA deberán tener una concentración aproximada de 100 ng/ul, que será verificada por el Técnico responsable de la QRTPCR (PCR Cuantitativa en Tiempo Real) El RNA no deberá estar degradado. Para comprobar el nivel de integridad de las muestras, éstas podrán ser analizadas empleando nano o picochips en el Bioanalizador 2100 de Agilent.