PCR a tiempo real

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ENSAYOS DE EXPRESION GÉNICA (SONDAS TAQMAN/SYBR GREEN). GENOTIPADO DE SNPS O CNVS (SONDAS TAQMAN) DETECCION DE HELICOBACTER MEDIANTE REAL TIME PCR TITULACIÓN DE VECTORES LENTIVIRALES MEDIANTE REAL TIME PCR ANALISIS DE RESULTADOS DE CON EL SOFTWARE STAMINER DE INTEGROMICS El sistema de Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR para cuantificación absoluta o relativa de expresión génica emplea para la cuantificación una reacción de PCR acoplada a un ensayo de emisión de fluorescencia. En el caso de la sonda fluorescente SYBR Green ésta se incorpora a los productos de PCR de doble cadena que se van generando durante la reacción. La principal desventaja de la utilización de esta química es la posibilidad de que la sonda fluorescente se una a subproductos de la reacción de PCR como primer-dimers o productos inespecíficos que también podrían generarse. Estos productos son fácilmente visibles cuando al final del ensayo de QRTPCR hacemos una curva de disociación del conjunto de los productos presentes en la reacción. Todas estas desventajas desaparecen cuando se emplean sondas Taqman en los ensayos de cuantificación de expresión génica. La discriminación alélica es el proceso por el cual se detectan en una muestra dos variantes de la secuencia de un único nucleótido. Los SNPs (Polimorfismos de Nucleótido Unico) son variaciones en un punto determinado de la secuencia nucleotídica de dos individuos. La tecnología Taqman puede emplearse también para el estudio de SNPs. En este caso las dos sondas Taqman presentes en el ensayo son cada una de ellas complementarias para cada uno de los SNPs. Cada una posee un fluorocromo diferente en el extremo 5¿ y un quencher en el extremo 3¿. Durante la fase de extensión de la reacción de PCR la DNA polimerasa rompe la sonda/as hibridadacon el DNA, separando el fluorocromo del quencher y detectándose emisión de flluorescencia de una de las sondas o de ambas. Se han identificado diferentes especies de la bacteria Helicobacter infectando animales de laboratorio. Las más comunes son: H. bilis, H. hepaticus, H. muridarum, H. rodentium y H. typhlonius. Estas bacterias pueden interferir con los resultados de laboratorio dado que se asocian a neoplasias hepáticas o intestinales y a enteritisproliferativa crónica. Además algunas especies de Helicobacter pueden infectar al hombre. Por todo ello, se hace necesaria la identificación de animales de laboratorio infectados.La detección puede llevarse a cabo mediante PCR en tiempo real amplificando una region altamente conservada entre especies del gen 16S rRNA 78-7284. 2006) o mediante amplificación de secuencias específicas de especie. El Servicio de genómica del IIBm lleva a cabo este ensayo utilizando primers y una sonda Taqmanespecíficos de secuencias del gen rRNA conservadas entre diferentes especies de Helicobacter en el equipo 7900HT Fast Real-Time PCR System de Applied Biosystems. El uso de vectores lentivirales en investigación básica y sus potenciales aplicaciones futuras requieren una metodología que permita cuantificar con exactitud los títulos lentivirales y la expresión de los transgenes virales en las células diana. El sistema de PCR en tiempo real de Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR emplea para la cuantificación una reacción de PCR acoplada a un ensayo de emisión de fluorescencia. En este caso se empleará una sonda Taqman frente a las secuencias de empaquetamiento presentes en muchos genomas virales. La titulación se llevará a cabo frente a diluciones seriadas de un plásmido que contiene las secuencias lentivirales Las preparaciones virales tendrán que tratarse con DNasa para eliminar el DNA empleado durante la transfección El Servicio emite un certificado con los resultados Para más información consultar: https://www.iib.uam.es/portal/web/genomica/normas