Identificación de proteínas por LC-ESI-MS/MS

Descripción de la prestación

La identificación y caracterización masiva de proteinas se lleva a cabo mediante nanocromatografia (que puede ser multidimensional) acoplada mediante una fuente nanospray a un espectrómetro de masas de alta resolucion Thermo Orbitrap Exploris OE240. La duración del gradiente cromatográfico (tipicamente ultracorto, corto, medio o largo) y el tipo de espectrómetro de masas empleado se decide en función de la complejidad estimada de la muestra a analizar, el número de identificaciones esperado, el grado de resolución y precisión de masa requerido y finalmente la sensibilidad necesaria. Los costes del servicio se ajustan en función de estos parámetros.

Descripción de la prestación

La identificación y caracterización masiva de proteinas se lleva a cabo mediante nanocromatografia (que puede ser multidimensional) acoplada mediante una fuente nanospray a un espectrómetro de masas de alta resolucion Thermo Orbitrap Exploris OE240. La duración del gradiente cromatográfico (tipicamente ultracorto, corto, medio o largo) y el tipo de espectrómetro de masas empleado se decide en función de la complejidad estimada de la muestra a analizar, el número de identificaciones esperado, el grado de resolución y precisión de masa requerido y finalmente la sensibilidad necesaria. Los costes del servicio se ajustan en función de estos parámetros.

Descripción de la prestación

A partir de una mezcla de proteínas de diversa complejidad (bandas de geles 1D, inmunoprecipitaciones, proteomas complejos, etc.) se lleva a cabo su identificación. Para ello, las proteínas son digeridas con una enzima, y los péptidos resultantes son analizados por cromatografía líquida de fase reversa acoplada a espectrometría de masas (nLC-msms). La digestión enzimática se realiza tanto a partir del recorte de una banda de un gel teñido, como a partir de proteínas en disolución previamente cuantificadas. Tras la digestión y antes de la introducción de la muestra en el cromatógrafo, se realiza la extracción peptídica y/o la limpieza de la muestra con resinas C18 (SPE). Para la separación cromatográfica se utiliza el equipo de nanocromatografía Easy-nLC II (Proxeon) con una columna C18 de 15 cm de longitud, y un gradiente cuya duración dependerá del grado de complejidad de la muestra, siendo de 10-20 min para una proteína purificada, 30-60 min para muestras sencillas (<5 proteínas), de 90-120 min para muestras de media complejidad (<50 proteínas), y de 150-180 min para muestras complejas (>50 proteínas). La salida del cromatógrafo está acoplada por medio de una fuente nano-electrospray (CaptiveSpray) al espectrómetro de masas de baja resolución de Trampa de Iones (IT) Amazon Speed ETD (Bruker), en el que se realizan ciclos de escaneado de masas (MS) de los péptidos eluidos ionizados, seguido de la selección automática y fragmentación (MS/MS) de los 3-10 péptidos más abundantes detectados en el ciclo anterior, con resoluciones de 0,3 a 0,5 uma. A partir de los datos de masas de los péptidos fragmentados se realiza la búsqueda en las bases de datos (SwissProt, Trembl, NCBI u otras especificadas por el usuario) utilizando el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science) integrado en otros programas informáticos como ProteinScape y BioTools (Bruker). El procedimiento estándar incluiría: - Carga de proteínas en gel, tinción con azul Coomassie y recorte manual de las bandas teñidas (si se realiza digestión en gel). - Reducción y carbamidometilación de proteínas. - Digestión de las proteínas con tripsina. - Limpieza con resina C18 (SPE) (si se realiza digestión en disolución) - Separación cromatográfica de los péptidos. Obtención de espectros de masas y de fragmentación de péptidos. - Procesado de datos de masas e identificación de proteínas en bases de datos. - Informe de resultados. INSTRUCCIONES DE ENVÍO DE MUESTRAS A partir de proteínas en GEL: 1.- El usuario deberá enviar el gel en agua Milli-Q (debidamente identificado), revelado con tinciones de Azul Coomassie, Sypro o Plata compatible con espectrometría de masas. Opcionalmente, el usuario puede enviar las bandas de proteínas ya recortadas, en tubos eppendorf de 1,5 ml identificados con el nombre de las muestras en la tapa de los mismos. El tamaño de los recortes de gel debe ajustarse a la zona teñida. 2.- Las muestras se entregarán junto con la solicitud correspondiente debidamente cumplimentada (SOLICITUD IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR MS o MSMS). Se deberá adjuntar la imagen del gel indicando las bandas a identificar. En el formulario se indicará la técnica de análisis solicitada, así como una estimación de la cantidad de proteínas. A partir de proteínas en DISOLUCIÓN o LIOFILIZADAS: 1.- Las proteínas en disolución o liofilizadas deberán ir en un tubo de 0,5 ml debidamente identificado con el nombre de la muestra en la tapa del mismo. 2.- Las muestras se entregarán o enviarán junto con la solicitud correspondiente debidamente cumplimentada (SOLICITUD IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR MS o MSMS), donde se especificará la concentración estimada de la muestra y la composición del disolvente (la cantidad de proteínas en el caso de muestras secadas o liofilizadas). En el formulario se indicará la técnica de análisis solicitada, así como el grado de complejidad de la muestra.

Descripción de la prestación

Los péptidos se separan mediante nano HPLC acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS), seguida del análisis de los datos de espectrometria de masas adquiridos. La identificación de los péptidos se realiza comparando los espectros de masas en tándem resultantes de la fragmentación peptídica con los espectros teóricos generados mediante digestión in silico de una base de datos de proteínas. Las proteínas se identifican asignándoles secuencias peptídicas únicas.