Peptide Mass Fingerprinting MS - MS/MS by MALDI TOF/TOF

Descripción del servicio

El enfoque más eficiente para la identificación rápida de proteínas aisladas de organismos secuenciados . El análisis se puede realizar a partir de una solución líquida de la proteína problema o a partir de bandas de proteínas separadas por electroforesis en gel. En este segundo caso, las manchas/ bandas con las proteínas diana se cortan del gel y las proteínas se digieren in situ con una enzima específica, generalmente tripsina. A continuación , los péptidos de digestión se extraen y analizan por MALDI TOF MS y MALDI TOF/TOF MS/MS.. MALDI TOF MS Una alícuota del digerido proteico se coloca en una placa MALDI donde se mezcla con una matriz (ácido alfa- ciano - 4 - hidroxicinamico habitualmente ) y se deja secar. La muestra cristalizada se analiza en un espectrómetro de masas MALDI -TOF ABSCIEX 4800 TOF / TOF (ABSciex , Barcelona) utilizando el modo reflector de iones positivos . El análisis se realiza en modo automático promediando los espectros obtenidos a partir de 4000-5000 disparos en el rango de m/z de 750 a 4500. Cada espectro se calibra externamente mediante el uso de una mezcla péptidos estándar ( des- Arg1 - bradiquinina (Mr 904.46 ) , Glu1 - fibrinopéptido B (Sr. 1.570,68 ) , la angiotensina - 1 , (Sr. 1.296,69 ) , ACTH 1-17 (Sr. 2.093,09 ) , ACTH 18-39 (Sr. 2.465,20 ) , ACTH 7-38 (Sr. 3.657,93 ) y , cuando es posible , una calibración interna usando los iones derivados de la auto- digestión con tripsina (Mr 842,5100 , 1045,5642 , 2011,1046 , 2807,3145 y 3337,7577 ) . los espectros obtenidos proveen de la masa exacta de los péptidos de digestión presentes en la muestra. Esta colección de masas de péptidos constituye una huella dactilar de la secuencia de proteína original. Las proteínas se identifican a partir de estas huellas utilizando herramientas bioinformáticas que las comparan con los perfiles esperados a partir de las secuencias en las bases de datos de proteínas. MALDI TOF/TOF MS/MS A veces , cuando se observan sólo unos pocos péptidos de digestión de una proteína o cuando hay interferencias en el espectro MALDI de otras proteínas contaminantes , el análisis PMF pueden fallar, producir resultados ambiguos o resultados de poca confianza . Para una identificación más precisa, el análisis PMF puede ser seguido por un análisis MS / MS donde varios de los iones más abundantes detectados en los espectros de PMF se seleccionan automáticamente y se fragmentan (MS/MS ) para obtener datos de secuencia adicional para la identificación inequívoca de de la proteína. Nota: Cuando la proteína no puede ser identificada via PMF or PMF-MS/MS, el digerido proteico puede analizarse por electrospray MS/MS (Ver LC MS/MS identification and nESI MS/MS identification). Este método es complementario al de MALDI-TOF/TOF ya que a menudo aporta una diferente selectividad de ionización así como una mayor eficiencia en la secuenciación.