Peptide Mass Fingerprinting by MS-MALDI TOF

Descripción de la prestación

A partir de digerido tríptico se realizará el análisis de los péptidos MALDI-TOF MS obteniéndose con ello un espectro característico y único con diferentes fragmentos trípticos que es los que se conoce como mapa o huella peptídica que nos permitirá la identificación de la proteína siempre que se encuentre en la base de datos. La huella peptídica (del inglés peptide mass fingerprinting, PMF) es una técnica analítica para la identificación de proteínas a partir de un digerido tríptico, cuyas masas se pueden medir con precisión mediante MALDI-TOF MS. Estas masas se comparan con una base de datos que contiene secuencias de proteínas conocidas. Las masas absolutas de los péptidos de cada proteína que se calculan teóricamente nos permitirá la comparación de masa entre los péptidos de la proteína desconocida y las masas peptídicas teóricas de cada proteína para encontrar el que se ajusta mejor. El análisis mediante PMF puede realizarse con proteínas en solución o con proteínas procedentes de SDS-PAGE previa modificación química. Las proteínas son digeridas en varios fragmentos mediante enzimas proteolíticas para generar los péptidos que serán analizados. Una pequeña fracción del péptido se deposita sobre la placa MALDI junto con la matriz adecuada y, a continuación las moléculas de la matriz y de péptido co-cristalizan en la placa de MALDI para proceder a su análisis. Tras insertar la placa en la cámara de vacío del espectrómetro de masas, la desorción e ionización de los fragmentos de polipéptido es iniciado por un haz láser. Los iones son acelerados en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector de iones, donde se detecta su llegada como una señal. El análisis de espectrometría de masas nos proporciona una lista de pesos moleculares de los fragmentos. Las masas de péptidos se comparan con bases de datos de proteínas tales como Swissprot, NCBInr, que contienen información de la secuencia de proteínas proporcionándonos posibles coincidencias. El espectrómetro de masas que utilizamos para el análisis es un Autoflex III MALDI-TOF-TOF. Para el procesamiento de los datos se utilizan diferentes software, siendo todos ellos Bruker. La adquisición de espectros de masas se hace con Flex Control, para el procesamiento de espectros y anotaciones usamos el Flex Analysis, y para el procesamiento adicional y búsqueda de datos se utilizan BioTools y Sequence Editor (Bruker). El motor de búsqueda que utilizamos para la identificación de proteínas es MASCOT (MatrixScience, UK).