Papel de las enzimas nitrato reductasa y citocromo c oxidasa de las raíces de soja en la emisión del gas de efecto invernadero óxido nitroso
Antecedentes: La agricultura es la principal fuente antropogénica óxido nitroso (N2O), un potente gas de efecto invernadero (GEI) con un alto potencial de calentamiento global. Las emisiones de N2O se deben principalmente al uso excesivo de fertilizantes nitrogenados sintéticos en las prácticas agrícolas modernas, que se transforman en N2O sobre todo a través de procesos microbianos de desnitrificación y nitrificación del suelo. La soja es un cultivo proteico emergente en Europa y España que presenta un gran potencial para mitigar las emisiones de N2O, al reducir la dependencia de la fertilización química gracias a su capacidad llevar a cabo la fijación biológica de N2 en asociación simbiótica con bacterias del suelo conocidas como rizobios. Sin embargo, las leguminosas también contribuyen directamente a las emisiones de N2O a través de la capacidad de desnitrificar de algunos rizobios en condiciones de vida libre o simbióticas. Resultados previos obtenidos en el Grupo de la Dra. Delgado (EEZ-CSIC) sugieren que, además de la desnitrificación del microsimbionte, proteínas codificadas por la planta pueden representar fuentes adicionales de N2O dentro de los nódulos (Alba Hidalgo-García et al., 2023, doi:10.108017429145.2023.2251511).
Hipótesis: La nitrato reductasa (NR) de las células vegetales reduce el nitrato a nitrito en el citosol, pero también posee una actividad secundaria (Ni-NOR), que reduce el nitrito a óxido nítrico (NO). A su vez, el NO podría reducirse a N2O mediante la forma reducida de la citocromo c oxidasa mitocondrial (CcO). Sin embargo, la participación de la NR y la CcO como nuevas fuentes vegetales de N2O en los nódulos de soja se desconoce.
Justificación: Para investigar la participación de NR y CcO en las emisiones de N2O por las raíces de soja, el objetivo principal de esta iMOVE es la generación de raíces transgénicas mediante ARN de interferencia (ARNi) para el silenciamiento de los genes GmNR y GmCcO de soja (Glycine max). El Dr. Boscari (Institut Sophia Agrobiotech-INRAe, Université Côte dAzur, CNRS, Francia) cuenta con una amplia experiencia en la transformación de raíces para silenciar los genes NR de Medicago truncatula basándose en la tecnología de ARNi (Berger et al., 2020. doi: 10.3389fpls.2020.01313). Por lo tanto, la estancia de la estudiante de doctorado Sara Pérez-González en el laboratorio del Dr. Boscari garantizará el éxito del proyecto propuesto.
Plan de trabajo: En primer lugar, se obtendrán las secuencias de los genes NR y CcO de la soja a partir de diferentes bases de datos genómicas: NCBI (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov), SoyBase (https:www.soybase.org) y Phytozome (www.phytozome.jgi.doe.gov) entre otras. Posteriormente, se diseñarán las construcciones de ARNi, utilizando protocolos y vectores ya establecidos en el laboratorio del Dr. Boscari. Las construcciones se transferirán a Agrobacterium rhizogenes K599 y se inocularán plántulas de soja para generar raíces transformadas siguiendo los protocolos disponibles en el laboratorio del Dr. Boscari. Una vez obtenidas y seleccionadas las raíces transformadas, se inocularán con Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110. Para verificar la regulación negativa, se analizará la expresión de los genes codificantes de la NR y CcO en raíces y nódulos mediante qRT-PCR. Los protocolos y plásmidos utilizados se transferirán al Grupo de la Dra. Delgado (EEZ-CSIC). Esta tecnología, así como los conocimientos adquiridos durante la iMOVE, serán utilizados por Sara Pérez-González para obtener raíces transgénicas frescas. Tras el crecimiento de las plantas, se analizará la emisión de N2O por las raíces transgénicas no noduladas o noduladas mediante cromatografía de gases, siguiendo la metodología disponible en el Grupo de la Dra. Delgado. Además, las raíces y los nódulos se almacenarán a -80 ºC para los análisis de actividad NR y CcO, cuyos protocolos también están disponibles en la EEZ-CSIC.