Preparación, purificación o cuantificación de muestras de DNA y RNA

Para usuarios externos que lo requieran, se realiza una extraccion del DNA procedentes de biopsia de tejidos (cola, oreja) o de clones de células ES que se envian para su análisis.
En el caso de microinyeccion de transgenes, la ultima purificacion y dilucion se realiza por el Servicio
En la generación de modelos basados en la utilización de CRISPR/Cas9, el servicio realiza la validación in vitro antes de su utilización en embriones o células

Purificación de Ácidos Nucléicos : ADN genómico, ADN plasmídico. Escalas : Miniprep, Midiprep y Maxiprep.
ARN total a partir de tejido o cultivos celulares.
Para más información contactar con la Unidad (ver Contacto en menú principal)

Extracción y purificación de muestras de ADN y ARN mediante los protocolos adecuados para cada tipo de muestra.
Para la cuantificación de ADN y ARN se dispone de un equipo Qubit (fluorómetro) o de un equipo Nanodrop ND-1000 (espectrofotómetro). Los resultados se expresan en ng/µl y en el caso del Nanodrop también se pueden facilitar los índices de pureza 260/280 y 260/230.

Extracción de ácidos nucleicos y cuantificación con nanodrop (ADN y ARN). Purificación de fragmentos amplificados por PCR

Extracción de ácidos nucleicos mediante el equipo Maxwell16 de Promega:
Extracciones realizadas por personal del servicio a partir de muestras de usuarios.
Uso autónomo del equipo.

Para usuarios externos que lo requieran, se realiza una extraccion del DNA procedentes de biopsia de tejidos (cola, oreja) o de clones de células ES que se envian para su análisis.
En el caso de microinyeccion de transgenes, la ultima purificacion y dilucion se realiza por el Servicio
En la generación de modelos basados en la utilización de CRISPR/Cas9, el servicio realiza la validación in vitro antes de su utilización en embriones o células

Muestras de ADN nativo o amplificado, serán purificadas y preparadas, en el caso de las amplificadas, para su secuenciación. En el caso de ADN nativo, su preparación, por ejemplo, para elaboración de genotecas, llevará a una adecuación de la concentración.

EXTRACCION DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE CÉLULAS, TEJIDOS, MUESTRAS FFPE..
El Servicio de Genómica dispone de un equipo para extracción automatizada de ADN o ARN de muestras de diversas procedencias. El Qiacube nos ha permitido automatizar la extracción de ácidos nucleícos empleando los kits de columnas de Qiagen para diferentes aplicaciones.
Hasta la fecha se han procesado en el Laboratorio muestras de sangre humana, cócleas de ratón y rata, cerebro, colas de ratón, páncreas, células en cultivo, muestras FFPE (testículo, piel, cerebro, páncreas, corazón, riñón, músculo, bazo, pulmón, próstata, estómago, hígado,intestino grueso..)¿lo que nos ha permitido tener puestos a punto más de 20 protocolos de extracción diferentes.
La calidad y cantidad de estas muestras puede posteriormente valorarse en el Servicio mediante cuantificación espectrofotométrica (Nanodrop); cuantificación fluorescente (Qubit); análisis de integridad del RNA (Bioanalizador) o PCR en tiempo real frente a endógenos como 18S o RPLP0 de muestras FFPE.
El Servicio emite un informe con los resultados
Consultar en https://www.iib.uam.es/portal/web/genomica/normas para más información y para ver cómo deben traerse las muestras al Servicio

Extracción de ácidos nucleicos y su preparación para efectuar otros análisis

Este servicio ofrece la extracción y purificación automática de ácidos nucleicos en formato mini.
Existen tres modalidades:
- DNA plasmídico
- DNA genómico a partir de cultivos celulares
- RNA total a partir de cultivos celulares
También se ofrece la cuantificación de ácidos nucleicos tanto por espectrofotometría con Nanodrop como por fluorometría con Qubit.
Las muestras biológicas para la extracción serán entregadas directamente personal de la Unidad acompañadas de la correspondiente solicitud y cumpliendo las indicaciones recogidas en nuestra web para cada una de las modalidades.
Una vez finalizado el proceso de extracción, se procederá a la cuantificación de las muestras mediante espectrofotometría en nanodrop y su almacenaje a -20ºC. Los usuarios serán avisados telefónicamente o a través de correo electrónico para que pasen personalmente a recoger sus muestras por el laboratorio de secuenciación junto con el informe espectrofotométrico. El horario de recogida será de lunes a viernes de 9 a 15 horas.
Equipamiento:
Robot Qiacube (Qiagen)
Espectrofotómetro Nanodrop ND-1000

Se han optimizado varios protocolos para la extracción de DNA y RNA, incluyendo protocolos a pequeña escala con fenol-cloroformo, sales o kits comerciales y a gran escala QiaCube con kits y métodos de extracción robotizados tanto por filtrado como por bolas magnéticas. Existen, asimismo, varios métodos para la cuantificación de las muestras a diferentes escalas. Para cuantificación a pequeña escala (una cada vez) se cuenta con un microespectrofotómetro (Nanodrop), pero también con los más precisos espectrofotómetros de amplio espectro y un fluorímetro. Para cuantificación a mayor escala (de 12 en 12) existe un BioAnalyzer (Agilent). Para escalas mayores (hasta 96) puede utilizarse el equipo de PCR a tiempo real.
Además en el laboratorio disponemos de un sistema de electroforesis, Pippin Prep, de selección por tamaño que nos permite aislar un fragmento deseado de ADN, paso muy importante en la preparación de librería genómicas.

En funcion de los objetivos del estudio y del material de partida, la extracción del DNA se puede realizar de diversas formas:
1) Extracción con disolventes orgánicos (Método del Cloroformo-Alcohol Isoamílico). Es utilizado cuando tenemos suficiente material de partida, por ej. sangre.
2) Purificación salina (Método del Acetato de Amonio), también empleado para sangre o tejido, y mediante este procedimiento evitamos utilizar disolventes orgánicos. Con ello conseguimos el mismo objetivo de desproteinizar la muestra sin los inconvenientes de la toxicidad.
Estos dos protocolos relativamente se utilizan para extraer DNA a partir de muestras de sangre de aves con el fin de caracterizar individuos en estudios posteriores.
Básicamente constan de las siguientes fases:
1) Lisis celular con un detergente aniónico (SDS, que solubiliza los componentes celulares de la membrana)
2) Desnaturalización y posterior precipitación salina de las proteínas y RNA contaminante, y eliminación por centrifugación.
3) Precipitación del ADN con Etanol.
4) Eliminación del etanol y resuspensión del DNA en agua MiliQ o en un tampón adecuado (Tris-Edta).
5) Cuantificación en nanodrop y visualización en gel de agarosa para comprobar su integridad
6) Conservación a 4ºC ó -20ºC, para su posterior amplificación.
Para caracterizar comunidades microbianas en suelos o muestras animales como secreciones, lavados cloacales, huevos y otras muestras, también se emplean Kits comerciales para la extracción del DNA, salvo el caso de los huevos de aves en los que se utiliza el Método Quélex.
Tanto si utilizamos kits específicos como el Método Quélex, los pasos comunes en ambos son :
1) Rotura de la pared celular bacteriana con Lisozima
2) Desnaturalización de proteínas y RNA (con Proteinasa K y RNasa)
En la extracción por Kits recuperamos el DNA mediante la precipitación con etanol y transferencia de la muestra a una columna en la que el DNA queda retenido en un filtro, y es eluido en pasos posteriores.
El "Método Quélex" destrulle las membranas celulares y las proteínas por ebullición y desnaturaliza el DNA, el cual es recuperado por centrifugación. Despues se vuelve a suspener el DNA en agua MilliQ o TE, y se guarda a 4ºC ó -20ºC, para su posterior amplificación por PCR (a veces puede ser requerida una purificación de la muestras mediante columnas concentradoras que eliminan posibles inhibidores de la PCR (Columnas UFC5100BK Amicon Ultra de Merck-Millipore).
Posteriormente tras la extracción y purificación se realiza la amplificación por PCR para obtener millones de copias de un fragmento determinado del genoma. Se amplifica una zona conservada del ARN-ribosomal 16S.
Utilizando cebadores específicos, marcados fluorescentemente, podremos amplificar la región de interés, para ser enviada posteriormente a un servicio externo de secuenciación ARISA (Automathed rRNA intergenic spacer analysis).