Peptide Mass Fingerprinting by MS-MALDI TOF

El mapeo mediante huella peptídica (PMF) es una técnica empleada para identificar proteínas mediante la coincidencia de las masas de sus fragmentos constituyentes (masas de péptidos) con las masas de los péptidos teóricos generados a partir de bases de datos de proteínas o de DNA. La primera etapa en el PMF es el corte de la proteína desconocida e intacta con una enzima proteolítica para generar péptidos. La enzima más comúnmente utilizada es tripsina. Usualmente se realiza un análisis MALDI-TOF tras el que se realiza un PMF en la base de datos. La premisa del mapeo peptídico es que toda proteína única tiene un conjunto único de péptidos y, por lo tanto, con masas de péptidos únicas. La identificación se realiza mediante la coincidencia de las masas de los péptidos observados con las masas teóricas derivadas de la base de datos. La identificación mediante PMF se basa en la observación de un alto número de péptidos, 5+, de la misma proteína con una gran exactitud de masa. Esta técnica funciona bien con spots de geles 2D donde la pureza de la proteína es mayor. La identificación de proteínas mediante PMF tiene dificultades con mezclas complejas de proteínas. Los bajos niveles de identificación a veces son debidos a la contaminación por queratinas.
Instrucciones para el usuario:
1. Los solventes empleados deben de ser de alto grado análitico.
2. El recipiente utilizado será preferiblemente nuevo.
3. Los usuarios extremarán la precaución en la manipulación para evitar la contaminación con queratinas.
4. Correr en un carril estándares de peso molecular no modificados.
5. Los usuarios traerán el gel al Servicio en metanol-acético-agua (50:10:40).
6. No cortar las bandas/spots.
Procedimiento:
Las bandas/spots de proteínas (de geles 1D o 2D) se digieren con tripsina (Promega, Madison, WI, USA) (1). Después de desalar la muestra, una alícuota (0,5 ul) del sobrenadante de la digestión tríptica se analiza directamente en un espectrómetro de masas de tipo MALDI-TOF, empleando un modelo Autoflex de Bruker Daltonic (Bremen, Alemania) equipado con un reflector y utilizando como matriz ácido 2,5-dihidroxibenzoico y una placa con superficie Anchor-Chip (Bruker Daltonic). Los espectros de masas obtenidos son utilizados como huella peptídica para la identificación de proteínas en bases de datos (NCBI no redundante, http://www.ncbi.nih.gov) empleando el programa MASCOT http://matrixscience.com (2).
Se considera la puntuación p1. Naranjo V, Villar M, Martín-Hernando MP, Vidal D, Höfle U, Gortazar C, Kocan KM, Vázquez J, de la Fuente J: Proteomic and transcriptomic analyses of differential stress/inflammatory responses in mandibular lymph nodes and oropharyngeal tonsils of European wild boars naturally infected with Mycobacterium bovis. Proteomics 2007, 7:220-231.
2. Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS: Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 1999, 20:3551-3367.

Las proteínas, en solución o incluidas en geles de poliacrilamida pueden analizarse por espectrometria de masas MALDI-TOF. En la digestion en solución, la muestra proteica se mezcla con un tampón acuoso (bicarbonarto amónico) y se añade tripsina (5%). La digestión de proteinas en gel es un poco más compleja e implica una serie de pasos. Primero las bandas de gel con proteínas se lavan con agua Milli-Q y después con acetonitrilo durante 10 min (los trozos de gel se deshidratan) y finalmente se rehidratan en bicarbonato amonico ( tampón de digestion). Para evitar la formación de puentes disulfuro no deseados entre cisteinas, las bandas se tratan con DTT 10 mM durante 30 min a 56ºC y posteriormente con iodoacetamida 55mM, 20min en oscuridad a 20ºC, quedando las cisteinas libres alquiladas. Los pasos de lavado se repiten.
Las bandas se incuban con proteasas (generalmente tripsina a 1 nmol por microlitro en bicarbonato amónico 50 mM durante 4h a 30ºC), que rompen las proteinas en una conjunto de peptidos. Los peptidos se extraen por sonicacion en trifluoracético 0.5%. Los péptidos se mezclan con una matriz adecuada (generalmente HCCA) sobre una placa de maldi y de la forma anteriormente indicada en la determinación de masas moleculares, en el maldi-tof, se obtiene un espectro característico y único para cada proteina que es lo que se conoce como huella peptídica (peptide mass fingerprinting). Los valores obtenidos de m/z del conjunto de péptidos de una proteína particular, se comparan con los teóricos de proteínas de secuencia conocidas ( mediantes algoritmos complejos), y se obtiene una puntuación a la identidad de la proteina en función de la correlación encontrada. La identificación correcta requiere que las base de datos contengan la secuencia específica de la proteína en cuestión (o al menos su correspondiente secuencia de ADN). En Internet hay diferentes motores de búsqueda para la identificacion de proteinas que utilizan algoritmos basados en teorías estadíticas complejas y en puntuaciones basadas en probabilidades. Nosotros generalmente usamos MASCOT de Matrix-Science (http://www.matrix-science.com).

A partir de digerido tríptico se realizará el análisis de los péptidos MALDI-TOF MS obteniéndose con ello un espectro característico y único con diferentes fragmentos trípticos que es los que se conoce como mapa o huella peptídica que nos permitirá la identificación de la proteína siempre que se encuentre en la base de datos.
La huella peptídica (del inglés peptide mass fingerprinting, PMF) es una técnica analítica para la identificación de proteínas a partir de un digerido tríptico, cuyas masas se pueden medir con precisión mediante MALDI-TOF MS. Estas masas se comparan con una base de datos que contiene secuencias de proteínas conocidas. Las masas absolutas de los péptidos de cada proteína que se calculan teóricamente nos permitirá la comparación de masa entre los péptidos de la proteína desconocida y las masas peptídicas teóricas de cada proteína para encontrar el que se ajusta mejor.
El análisis mediante PMF puede realizarse con proteínas en solución o con proteínas procedentes de SDS-PAGE previa modificación química. Las proteínas son digeridas en varios fragmentos mediante enzimas proteolíticas para generar los péptidos que serán analizados.
Una pequeña fracción del péptido se deposita sobre la placa MALDI junto con la matriz adecuada y, a continuación las moléculas de la matriz y de péptido co-cristalizan en la placa de MALDI para proceder a su análisis. Tras insertar la placa en la cámara de vacío del espectrómetro de masas, la desorción e ionización de los fragmentos de polipéptido es iniciado por un haz láser. Los iones son acelerados en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector de iones, donde se detecta su llegada como una señal. El análisis de espectrometría de masas nos proporciona una lista de pesos moleculares de los fragmentos. Las masas de péptidos se comparan con bases de datos de proteínas tales como Swissprot, NCBInr, que contienen información de la secuencia de proteínas proporcionándonos posibles coincidencias.
El espectrómetro de masas que utilizamos para el análisis es un Autoflex III MALDI-TOF-TOF. Para el procesamiento de los datos se utilizan diferentes software, siendo todos ellos Bruker. La adquisición de espectros de masas se hace con Flex Control, para el procesamiento de espectros y anotaciones usamos el Flex Analysis, y para el procesamiento adicional y búsqueda de datos se utilizan BioTools y Sequence Editor (Bruker). El motor de búsqueda que utilizamos para la identificación de proteínas es MASCOT (MatrixScience, UK).

El enfoque más eficiente para la identificación rápida de proteínas aisladas de organismos secuenciados. El análisis se puede realizar a partir de una solución líquida de la proteína problema o a partir de bandas de proteínas separadas por electroforesis en gel. En este segundo caso, las manchas/ bandas con las proteínas diana se cortan del gel y las proteínas se digieren in situ con una enzima específica, generalmente tripsina. A continuación, los péptidos de digestión se extraen y analizan por MALDI TOF MS.
MALDI TOF MS
Una alícuota del digerido proteico se coloca en una placa MALDI donde se mezcla con una matriz (ácido alfa-ciano-4 -hidroxicinamico habitualmente) y se deja secar. La muestra cristalizada se analiza en un espectrómetro de masas MALDI -TOF (4800 TOF/TOF, ABSciex) utilizando el modo reflector de iones positivos . El análisis se realiza en modo automático promediando los espectros obtenidos a partir de 4000-5000 disparos en el rango de m/z de 750 a 4500. Cada espectro se calibra externamente mediante el uso de una mezcla péptidos estándar ( des- Arg1 - bradiquinina (Mr 904.46 ) , Glu1 - fibrinopéptido B (Sr. 1.570,68 ) , la angiotensina - 1 , (Sr. 1.296,69 ) , ACTH 1-17 (Sr. 2.093,09 ) , ACTH 18-39 (Sr. 2.465,20 ) , ACTH 7-38 (Sr. 3.657,93 ) y , cuando es posible , una calibración interna usando los iones derivados de la auto-digestión con tripsina (Mr 842,5100 , 1045,5642 , 2011,1046 , 2807,3145 y 3337,7577 ). Los espectros obtenidos proveen de la masa exacta de los péptidos de digestión presentes en la muestra. Esta colección de masas de péptidos constituye una huella dactilar de la secuencia de proteína original. Las proteínas se identifican a partir de estas huellas utilizando herramientas bioinformáticas que las comparan con los perfiles esperados a partir de las secuencias en las bases de datos de proteínas.
Nota:
Cuando la proteína no puede ser identificada vía PMF o se requiere una validación de los datos PMF, es posible realizar un análisis TOF/TOF MS/MS sobre la misma muestra (Ver Peptide Mass Fingerprinting MS - MS/MS BY MALDI TOF/TOF). El digerido proteico puede analizarse también por electrospray MS/MS (Ver LC MS/MS identification and nESI MS/MS identification). Este método es complementario al de MALDI-TOF ya que a menudo aporta una diferente selectividad de ionización así como una mayor eficiencia en la secuenciación. Sin embargo, la identificación mediante ESI MS/MS requiere un tiempo mayor y tiene un mayor coste económico.