Electroblotting

Descripción del servicio

Una de las tareas que se llevan a cabo en la EEZA dentro del laboratorio de Fisiología Animal para diferenetes estudios de Evolutionary Ecology es la de Western blot para la transferencia, inmovilización y detección de proteínas de estrés a partir de células rojas de la sangre de diferentes especies de aves, entre las que se encuentran, al menos, tres especies de pingüinos. En esta técnica, las proteínas de una muestra compleja se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida según sus propiedades de carga y tamaño pues los geles de poliacrilamida presentan tamaño de poro cercano al tamaño de las proteínas y funcionan como un tamiz molecular en el que podemos variar el tamaño de poro variando la composición del gel. En este tipo de electroforesis las proteínas que se someten a migración son previamente desnaturalizadas y sufren la pérdida de su estructura tridimensional por la acción de un detergente iónico dodecilsulfato sódico, esta unión bloquea la carga propia de la molécula de proteína y confiere a los complejos detergente-proteína cargas uniformes negativas haciendo que todas las proteínas migren hacia el ánodo siendo su movilidad mayor o menor dependiendo de la masa molecular de la proteína (a menor masa molecular mayor movilidad y viceversa) de esta forma podemos determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína, por comparación con un patrón conocido (marcadores de peso molecular) pues la velocidad de separación en estas condiciones es proporcional a la masa de la proteína. A continuación, las proteínas se transfieren a una membrana hidrofóbica de nitrocelulosa, utilizando un campo eléctrico perpendicular al gel y una vez transferidas las proteínas quedan en su superficie accesibles para interaccionar con otras moléculas que permiten su detección específica. Para evitar uniones inespecíficas y un aumento de la señal basal, se bloquean las zonas de la membrana que no hayan sido cubiertas por proteínas, utilizando proteínas u otras moléculas que no sean reconocidas por los anticuerpos primarios y secundarios. A continuación, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico del antígeno. Después de varias etapas de lavado, se incuba con un anticuerpo secundario marcado dirigido contra el anticuerpo primario. El marcaje se realiza mediante la unión covalente de enzimas. Finalmente las bandas de proteína reconocidas por los anticuerpos son reveladas tras incubación con sustratos que generen productos coloreados insolubles.